GDS-80基因枪粒子轰击微绿球藻转化建立遗传改良转化工具箱

　　由于对传统矿物燃料的依赖，人们对潜在的能源危机和环境问题越来越关注，为满足经济和社会发展对能源的需求，实现资源的永续利用，促进环境，资源，社会经济的协调发展，能源问题越来越受到各国研究者的重视。微绿球藻是最有前途的生物燃料和天然产品的原料。相比其他生物燃料原料，如作物和其他陆地植物，微绿球藻具有高脂含量和快速增长的速度。 此外，它们不需要耕地或淡水进行种植，可以利用烟气中的二氧化碳进行生长。微绿球藻是一种很有吸引力的生物燃料和二十碳五烯酸(EPA)等高附加值产品的工业生产菌株，其生长速度快，脂肪含量高。

　　微藻的转化方法主要有三种：玻璃微珠搅拌法、电穿孔法和基因枪粒子轰击法。 玻璃微珠搅拌和电穿孔通常用于转化细胞壁缺乏或变弱的微藻。对于具有硬细胞壁的微藻，如硅藻，DNA包覆金属粒子轰击靶细胞是一个普遍的，简单的，有效的和高重现性的转化方法。该方法已成功地用于大多数标准的细胞表达系统的转化。基因枪粒子轰击法的主要缺点是需要专门的设备成本，但它仍然是叶绿体转化的最有效的方法，因为它允许重组DNA的多个副本传输通过细胞膜和叶绿体膜，这增加了成功整合事件发生的机会。此方法已被证明对于稳定的核转化和叶绿体转化、在衣藻转化、团藻转化、小球藻、椭圆小球藻、雨生红球藻瞬时转化和稳定的核变换的硅藻三角褐指藻都是有效的。 也是细胞器转化的首选方法。值得注意的是，叶绿体转化可用于微藻细胞工厂生产异源蛋白质和增值产品。有一些报道根据转化方法描述了转化子的长期稳定性。根据统计分析，90.6%的作者使用了轰击法，66.6%和33.3%的作者使用了玻璃珠和电穿孔法，报告了表型的长期稳定性。这一统计分析表明，与玻璃珠法和电穿孔法相比，基因枪轰击后，外源DNA在转化子基因组中的存在与长期存活正相关。

　　韩国科学技术院（KAIST）（也称韩科院，环太平洋大学联盟成员）化学与生物分子工程系在Bioresource Technology杂志发表了使用GDS-80基因枪建立微绿球藻稳定转化体系，首次报道了一种外源荧光蛋白在微绿球藻中的过度表达和检测，开发了可用于未来遗传改良的转化工具箱。 微绿球藻属于单细胞，浮游生物，具有2-4um直径的亚球形或3-4×1.5um圆柱形细胞，是一种非常小的细胞类型。通过GDS-80基因枪进行粒子轰击转化，在TUB和UEP启动子的调控下表达Shble，获得对Zeocin抗生素的抗性，每10的8次方个细胞中分别有5.9和4.7个转化子。利用限制性内切酶位点定向扩增(RESDA)PCR证实了这些标记与基因组的稳定整合。

　　实验方法如下：首先构建携带内源性TUB启动子，TUB终止子和Shble基因(编码对zeocin的抗性)的pNsShble质粒。通过乙醇沉淀法纯化被Xbal线性化的pNsShble。使用2.5M氯化钙，和0.1M亚精胺将线性化的pNsShble包埋到金粉上。用70%乙醇洗涤金粉混合液，并重悬于100%乙醇中。在改良的F2N培养基中培养N.salina细胞。将醋酸纤维素膜滤器上的10的8次方个细胞置于F2N琼脂培养基上。使用GDS-80低压基因递送系统(Wealtec，USA)进行粒子轰击：625ug金粉/枪，1ug线性化质粒，3cm距离。轰击转化后，将5个醋酸纤维素膜滤器上的细胞在改良的F2N液体培养基中于25℃，5umol光子/平方米/s的荧光下培养1天。收获所有细胞并接种在含有2.5ug/mL zeocin和F2N琼脂培养基上。

　　异源蛋白sfCherry荧光蛋白首次在微绿球藻中高表达和可视化。采用粒子轰击法，用TUB和UEP启动子表达Shble基因，每10的8次方个细胞分别获得5.9和4.7个转化子。经RESDA-PCR证实，基因整合确保了转基因的稳定表达。 此外，通过western blotting和共聚焦显微镜证实了sfCherry荧光蛋白的转基因表达和正确功能。这些结果为微绿球藻的遗传操作提供了技术支持，有助于生物制品的稳定转化和生产。

　　参考文献：

　　Heterologous overexpression of sfCherry fluorescent protein in Nannochloropsis salina[J]. Biotechnology Reports, 2015, 8(C):10-15.